Предисловие

тема：Single-cell RNA-seq reveals cell type–specific molecular and genetic associations to lupus Дата: 8 апреля 2022 г. Журнал:Наука Ссылка: https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.abf1970.

краткое содержание

Системная красная волчанка (СКВ) — гетерогенное аутоиммунное заболевание, поражающее несколько систем органов, с более высокой распространенностью среди женщин и людей азиатского, африканского и латиноамериканского происхождения. Большое количество традиционных транскриптомных исследований показало, что отличительными признаками СКВ являются усиление сигнальных путей интерферона I типа, нарушение регуляции активации лимфоцитов и нарушение апоптотического клиренса. Текущее понимание общей картины циркулирующих иммунных клеток у пациентов с СКВ остается неполным, а аннотация типов клеток и клеточных контекстов, которые опосредуют генетические ассоциации, остается сложной задачей.

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) РВМС является комплексным, объективным методом одновременного анализа состава циркулирующих иммунных клеток и транскрипционного статуса, специфичного для типа клеток, но его применение в популяционных когортах затруднено из-за низкой пропускной способности образцов. , высокая стоимость и другие ограничения. Чтобы преодолеть эти ограничения, исследовательская группа из Калифорнийского университета в Сан-Франциско разработала «мультиплексный scRNA-seq», или сокращенно mux-seq, который может систематически и экономично выполнять одноклеточное секвенирование популяционных когорт.

В статье был проведен анализ секвенирования отдельных клеток более чем 1,2 миллиона мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от 162 пациентов с системной красной волчанкой и 99 здоровых людей азиатского или европейского происхождения из контрольной группы с целью изучения экспрессии генов определенных типов клеток в процессах, связанных с СКВ. . изменять.

методы исследования

Авторы использовали образцы из Калифорнийского института эпидемиологии волчанки (CLUES) и консорциума ImmVar, в которых были секвенированы 1,2 миллиона мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из 264 независимых образцов.

264 независимых образца и 91 образец-дубликат были смешаны в 23 образца и испытаны в 4 партиях. В партии 3 (155034 клеток) и партии 4 (375261 клетка) использовали 16 и 99 поверхностных антител соответственно для анализа экспрессии белков клеточной поверхности.

Контроль качества дал 1 444 450 клеток. Затем используйте Scrublet для удаления дублетов, загрязняющих тромбоциты и эритроциты, в результате чего в окончательном наборе данных останется в общей сложности 1 263 676 клеток.

CD4+ Т-клеточная лимфопения у больных СКВ

В результате кластеризации получилось 23 кластера, а затем аннотация привела к 11 типам ячеек:

CD14+ classical and CD16+ nonclassical monocytes (cM and ncM); conventional and plasmacytoid dendritic cells (cDC and pDC); CD4+ and CD8+ T cells (CD4 and CD8); natural killer cells (NK); B cells (B); plasmablasts (PB); proliferating T and NK cells (Prolif); and progenitor cells (Progen)

• По сравнению с контрольной группой наиболее значительным изменением в группе СКВ было снижение CD4 и увеличение клеток cM, а в азиатских случаях наблюдалось большее снижение процента CD4;
• Сравнение дополнительных 100 случаев со 154 контрольными пациентами выявило значительное снижение содержания лимфоцитов, но отсутствие различий в количестве моноцитов.
• Для оценки лимфопениииSLEСуществует ли причинно-следственная связь между,Автор использует генетические данные и состав иммунных клеток. GSMR пакет для анализа. Было обнаружено, что варианты, связанные с обилием лимфоцитов, обратно связаны с риском СКВ. Однако не было показано опосредующего влияния риска СКВ на лимфопению.

Снижение количества наивных CD4+ Т-клеток и увеличение цитотоксических CD8+ Т-клеток при СКВ.

Предыдущие исследования показали, что в лимфоцитах больных СКВ нарушена активация Т- и В-клеток памяти, а экспрессия ISG (интерферон-стимулированных генов) повышена. Чтобы изучить изменения в профиле экспрессии популяций лимфоцитов при СКВ, авторы повторно агрегировали лимфоциты и аннотировали полученные 26 клеточных кластеров на 14 субпопуляций, 7 субпопуляций Т-клеток, 2 субпопуляции NK-клеток, 4 субпопуляции В-клеток и 1 субпопуляцию Т-клеток. Субпопуляция прогенных клеток. Не было обнаружено существенных различий между подпопуляциями NK- и B-клеток при СКВ и контрольной группе.

О CD4+Т-клетках

Три подгруппы клеток CD4+ T: CD4Naive [наивные незрелые клетки, экспрессирующие CCR7], CD4EM [эффекторные клетки памяти, лишенные экспрессии CCR7 и экспрессирующие рецептор OX40 (TNFRSF4) и IL7R), CD4Reg [экспрессирующие фактор транскрипции FOXP3 и его прямое нацеливание на регуляторные клетки РТКН2]. Наиболее значимым изменением при СКВ было снижение CD4Naive по сравнению с контролем. Доля CD4Naive не была значимо связана с возрастом или лечением.

О CD8+Т-клетках

Четырьмя субпопуляциями клеток CD8+ T являются: CD8Naive [субпопуляция наивных клеток, экспрессирующая CCR7], CD8MAIT [экспрессирующая KLRB1, GZMK] и две субпопуляции эффекторной памяти CD8GZMH и CD8GZMK, которые лишены KLRB1 и экспрессируют CCL5, PRF1 и LAG3.

• CD8GZMH и CD8GZMK можно отличить по экспрессии гранзимов (GZMH, GZMB и GZMK). По сравнению с контролем процент CD8GZMH был значительно увеличен, а процент CD8MAIT снижен в некоторых случаях.
• Корреляция между цитотоксичностью и генами-сигнатурами ISG и генами-сигнатурами цитотоксичности и истощения, как правило, была низкой во всех клетках. Для дальнейшего исследования клональности CD8GZMH и CD8GZMK авторы выполнили амплификационное секвенирование области CDR3 Т-клеточного рецептора (TCR) и получили парные последовательности TCRA и TCRB из 10,2% CD4 и 8,7% CD8. Среди расширенных клонов CD8 59% были получены из клеток CD8GZMH и 21% - из клеток CD8GZMK. По сравнению с контролем, в случаях наблюдался ограниченный репертуар клеток CD8. В субпопуляции CD8GZMH соотношение клеток, экспрессирующих цитотоксические характеристики, к клеткам, экспрессирующим характеристики ISG после размножения, составляет примерно 4:1.

Интерферон I типа стимулирует экспрессию генов миелоидных клеток при СКВ

В случаях и в контрольной группе миелоидные клетки показали наибольшее количество ДЭГ. Для дальнейшего изучения их гетерогенности авторы объединили миелоидные клетки в 6 субпопуляций:

• Линия мононуклеарных клеток (cM: CD14+; ncM: FCGR3A+; ncMcomp: C1QA+ /FCGR3A+)
• Линии дендритных клеток (cDC1: CLEC10A+; cDC2: CLCEC9A+; pDC: IRF7+)

По сравнению с клетками костного мозга в контрольной группе процентное содержание pDC, cDC1 и cDC2 было снижено, а процентное содержание cMs и ncMcomps было увеличено в основной группе.

Используя скорость РНК для оценки транскрипционной гетерогенности каждого типа миелоидных клеток, клетки пациента с СКВ были обогащены высокоактивированными областями среди cM, ncM и ncMcomps, и результаты были схожими для популяций клеток cDC.

Пациенты с более высоким индексом SLEDAI (индекс активности заболевания СКВ) имеют более высокую степень активации клеток. Средняя степень предполагаемой активации клеток в европейских случаях лучше коррелировала с SLEDAI, чем в азиатских случаях.

Клиническое прогнозирование и молекулярное типирование болезненных состояний СКВ

Одной из диагностических трудностей СКВ является широкая гетерогенность проявлений заболевания, сопровождающаяся слабой корреляцией между отдельными клиническими особенностями и показателями генных модулей. Поэтому авторы использовали экспрессию каждого гена модуля как характеристику для клинического прогнозирования и молекулярной классификации СКВ. Хотя 302 сигнатуры экспрессии имели хорошую прогностическую силу для различения статуса контроля СКВ (AUC = 0,84), их прогностическая способность для отдельных клинических признаков была ограничена, что отражает слабую корреляцию между клиническими признаками и оценками модулей.

Молекулярно классифицировать случаи,Авторы провели анализ главных компонент особенностей экспрессии.,Затем выполните кластеризацию K-средних на 2 группы.,PC1 оказался наиболее родственным генам модулей Panup и Myeup и Bup.,К ним относятсяIFITM3Миелоидно-специфическая экспрессия。использоватьmux-seqПолученные профили экспрессии, специфичные для типа клеток, можно использовать для корреляции изменений внутреннего состояния клетки.,Может использоваться для прогнозирования случая и статуса контроля,И провести молекулярное типирование больных СКВ.

image-20230102112142011

Специфические для типа клеток генетические эффекты модификации интерферона на экспрессию генов

Авторы хотели выяснить, может ли вариабельная активация интерферона I типа, наблюдаемая у пациентов с СКВ, изменить генетические эффекты на экспрессию генов in vivo.

35 цис-eQTL и Panup были идентифицированы в случаях генов, взаимодействующих с сигнальными генами SCV ISG.,позвони этоIFN-eQTL。Интерфероновый ответ, ранее обнаруженный в дендритных клеткахcis-eQTLs （reQTLs）существоватьcMsУмеренно значимый,但существовать其他类型из细胞中不显著。作者существовать骨髓иBреплицируется в клеткахrs11080327（A>G）какSLFN5изIFN-eQTL,但существоватьNKилиTНе может реплицироваться в клетках。Обнаружитьrs11080327существовать淋巴母细胞系中为cis-eQTL,существоватьrIFNB1В регулируемых дендритных клеткахcis-reQTL。

Затем авторы выполнили одноклеточную ATAC-секцию mux-seq на 5 PBMC и обнаружили, что геномная область рядом с rs11080327 была менее доступна в большинстве типов клеток и имела генотип-зависимое увеличение доступности после стимуляции.

Приведенные выше результаты указывают на то, что область, перекрывающаяся с rs11080327, содержит цис-регуляторный элемент, который активируется интерфероном I типа. Это предполагает, что генетические различия могут не только предрасполагать людей к системной красной волчанке, но также могут влиять на реакцию человека на это болезненное состояние.

краткое содержание

В этой статье с помощью Mux-Seq было проанализировано более 1,2 миллиона РВМС у пациентов с системной красной волчанкой. Было обнаружено, что на уровне клеточного состава количество наивных CD4+ Т-клеток было снижено у пациентов с СКВ (особенно азиатской линии), что может объяснить клинически наблюдаемую лимфопению у пациентов с СКВ. На уровне транскрипции cMs и ncMs генерируют большинство сигнатур ISG типа I, включая гены, специфичные для миелоидных клеток. Благодаря совместному анализу цис-eQTL и результатов полногеномных ассоциативных исследований можно идентифицировать типы клеток, имеющие отношение к лечению иммунных заболеваний, и точно определить местонахождение участков, связанных с заболеванием, что позволяет обнаруживать новые сайты, связанные с СКВ.