Текущая одноклеточная транскриптомика в определенной степени задействована с точки зрения размера выборки, методов анализа и влажных экспериментов. Другая тенденция заключается во внедрении одноклеточной мультиомики (например, scATAC-seq и т. д.) и пространственных измерений. включая пространственную группу транскрипции, пространственный метаболом, пространственный протеом, пространственный ATAC и т. д.

Что касается изучения пространственного анализа транскриптома, я рекомендую сначала изучить анализ транскриптома одной клетки и овладеть навыками чтения данных одной клетки, рутинного анализа, интеграции и разделения пакетов, а также некоторого расширенного анализа (например, псевдохронологического анализа, фактора транскрипции). и анализ клеточной коммуникации), на этой основе можно очень быстро понять и изучить пространственный транскриптом одной клетки. Официальный документ Сёра (https://satijalab.org/seurat/articles/spatial_vignette.html) представляет собой. хороший вводный урок.

Прежде чем изучать это руководство по холостому ходу, я сначала расскажу, как считывать данные холостого хода на языке R, а затем конструировать их в объект Сёра.

1. Введение

космосданные Как хранить вSeuratсередина？

Данные Visium из 10x включают в себя следующие типы данных:

• Получите точку (пятно) через матрицу экспрессии генов
• Изображения срезов тканей(коллекцияданныечасH&Eкрашение)
• Коэффициент масштабирования исходного изображения с высоким разрешением и изображения с низким разрешением, используемого для отображения.

В объекте Сёра матрица экспрессии «Спот по генам» аналогична типичному анализу «РНК», но содержит данные на уровне пятна, а не на уровне одной клетки. Само изображение хранится в слоте изображений объекта Сёра. Слоты изображений также хранят необходимую информацию для связи пятен с их физическим расположением на изображениях тканей.

image-20230312105819088

Последующая обработка холостого хода аналогична обработке отдельных ячеек и в основном включает:

• Высадка на клеточном уровне,Считайте в R как Seuratобъект;
• Двухсотовое предсказание (необязательно);
• Низкокачественная клеточная фильтрация (опция);
• Стандартизированный выбор и нормализация функций;
• Кластеризация с уменьшением размерности;
• Групповая аннотация;
• Анализ дифференциальной экспрессии позволяет получить маркеры признаков.

Судя по аннотированным данным, последующий анализ обычно можно классифицировать как персонализированный анализ. Как и анализ отдельных клеток, он в основном включает в себя:

• Анализ обогащения: например, анализ обогащения GO, KEGG и GSEA;
• Транскрипционный факторный анализ;
• Квазихронометрический анализ холостого хода;
• Анализ простоя сотовой связи;
• ......

2. Как читать пустые данные на языке R

Шаг 1. Загрузка и установка пакета R.

library(Seurat)
library(SeuratData)
library(ggplot2)
library(patchwork)
library(dplyr)

Шаг 2. Загрузите данные.

Существуют разные стратегии загрузки для разных типов данных:

(1) Загрузите образец данных с официального сайта Seurat.

Пример данных доступен по адресу https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets.,и использоватьLoad10X_Spatial()функциязагрузить его вSeurat。Это будет читатьspacerangerВыход трубы,и вернутьсяSeuratобъект,Объект содержит данные экспрессии на уровне пятна и связанные изображения срезов тканей.

Пример данных в этой статье относится к платформе 10X.,встроен вSeuratDataRСумка,Способ загрузки следующий:

InstallData("stxBrain")
brain <- LoadData("stxBrain", type = "anterior1")
brain
# An object of class Seurat 
# 31053 features across 2696 samples within 1 assay 
# Active assay: Spatial (31053 features, 0 variable features)

## Проверьте пример данных
head(brain@meta.data)
#                   orig.ident nCount_Spatial nFeature_Spatial slice   region
# AAACAAGTATCTCCCA-1  anterior1          13069             4242     1 anterior
# AAACACCAATAACTGC-1  anterior1          37448             7860     1 anterior
# AAACAGAGCGACTCCT-1  anterior1          28475             6332     1 anterior
# AAACAGCTTTCAGAAG-1  anterior1          39718             7957     1 anterior
# AAACAGGGTCTATATT-1  anterior1          33392             7791     1 anterior
# AAACATGGTGAGAGGA-1  anterior1          20955             6291     1 anterior
SpatialDimPlot(brain,alpha = 0)

#Дополнительная ссылка на параметры
?SpatialDimPlot()

(2) Загрузите выходные данные восходящего канала 10X Cellrange.

Обычный процесс не будет использоватьсяLoadDataфункциячитатьданные,Потому что обычно мы получаем 10 X Space RangerВыходной результат：

Ниже приведены данные, загруженные с официального сайта 10X:

https://www.10xgenomics.com/resources/datasets?query=&page=1&configure%5Bfacets%5D%5B0%5D=chemistryVersionAndThroughput&configure%5Bfacets%5D%5B1%5D=pipeline.version&configure%5BhitsPerPage%5D=500&configure%5BmaxValuesPerFacet%5D=1000&menu%5Bproducts.name%5D=Spatial%20Gene%20Expression

test_data = Load10X_Spatial(data.dir = "./input/",
                           filename = "Visium_FFPE_Human_Normal_Prostate_filtered_feature_bc_matrix.h5",
                           assay = "Spatial", 
                           slice = "test")
head(test_data@meta.data)
SpatialDimPlot(test_data,alpha = 0)

#Так же, как и данные одной ячейки, эти имена можно изменить вручную
test_data@project.name <- "test"
Idents(test_data) <- "test"
test_data$orig.ident <- "test"

image-20230224173610241

## Получить координаты изображения среза:
img<- GetTissueCoordinates(test_data)
img$imagerow = 540-img$imagerow
write.csv(img,file = "./No_IHC/position_information.csv")
head(img)
#                     imagerow imagecol
# AAACAAGTATCTCCCA-1 183.3725 434.0820
# AAACAATCTACTAGCA-1 442.7995 247.5663
# AAACAGAGCGACTCCT-1 381.8799 409.0720
# AAACAGCTTTCAGAAG-1 222.4493 139.4663
# AAACCCGAACGAAATC-1 210.8508 475.3213
# AAACCGGAAATGTTAA-1 161.2021 503.7606

(3) Чтение нетрадиционных данных

3.1 Отсутствующие изображения ИГХ

Иногда данные, загруженные из базы данных, из-за отсутствия изображений ИГХ можно прочитать следующими способами:

# Считайте данные пространства как данные одной ячейки.
test_data2 = Read10X("./input/filtered_feature_bc_matrix/")
test_data2 <- CreateSeuratObject(counts = test_data2, 
                                min.features = 0, 
                                project = "test")
test_data2
# An object of class Seurat 
# 17943 features across 2543 samples within 1 assay

Если данных IHC о холостом ходу нет, автор обычно предоставляет информацию о местоположении:

# Чтение информации о положении одной ячейки
position = read.csv("./No_IHC/position_information.csv",header = T,row.names = 1)
head(position)
position = select(position,imagecol,imagerow)

#Включить информацию о местоположении в одну ячейку seuratobject
colnames(position) = paste0("Spatial_",1:ncol(position))
test_data2[["spatial"]] <- CreateDimReducObject(embeddings = as.matrix(position), 
                                                    key = "Spatial",assay = "RNA")
DimPlot(test_data2,reduction = "spatial",pt.size = 1)

3.2 При отсутствии ИГХ-изображений можно также использовать метод Slide-seq.

test_data2 = Read10X("./input/filtered_feature_bc_matrix/")
test_data2 <- CreateSeuratObject(counts = test_data2,
                                min.features = 0,
                                project = "test", 
                                assay="Spatial")
test_data2
# An object of class Seurat 
# 17943 features across 2543 samples within 1 assay 
# Active assay: RNA (17943 features, 0 variable features)

coord.df = read.csv("./position_information.csv",header = T,row.names = 1)
test_data2@images$image =  new(
  Class = 'SlideSeq',
  assay = "Spatial",
  key = "image_",
  coordinates = coord.df
)

test_data2
SpatialDimPlot(test_data2)

Выше приведены несколько распространенных методов чтения пустых данных на язык R.

- END -